亚洲人av一区二区-久久99精品美女-丰满熟妇一区二区三区-情欲av一区二区三区-亚洲日本成人一区99

如何構(gòu)建耐藥細胞株？

腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是腫瘤治療失敗的重要因素之一，成為目前阻礙腫瘤治療的絆腳石。因此，探索腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥的原因以及如何改善腫瘤細胞對化療藥物耐藥仍是目前研究的熱點和難點。

腫瘤細胞耐藥的產(chǎn)生是一個復(fù)雜的過程，它的機制廣泛牽涉到藥物代謝學(xué)、病理學(xué)、生理學(xué)等多個學(xué)科，這就決定了腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥的機制是復(fù)雜的，因此體外建立化療藥物耐藥細胞株仍然是研究腫瘤細胞耐藥機制的重要方法。

一種藥物長期作用于某類細胞，殺死其中沒有抗性的細胞，而對這類細胞中具有抗性的細胞不能殺死，即進行了選擇。具有抗性的細胞大量繁殖產(chǎn)生很多抗性后代，但再用這種藥物時表現(xiàn)出的藥效大大下降的現(xiàn)象就是細胞的耐藥性，采用體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法誘導(dǎo)腫瘤細胞對特定藥物產(chǎn)生耐藥性，從而構(gòu)建出對特定藥物產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細胞株。

耐藥細胞株構(gòu)建的原理

細胞與低劑量的藥物長期接觸，引起細胞本身藥物化學(xué)過程的改變，細胞膜上出現(xiàn)Pgp糖蛋白，使細胞逐漸對藥物耐受，隨著藥物濃度的遞增，其耐受程度逐漸加強。　　

耐藥細胞株構(gòu)建方法

A.  檢測親本細胞株的IC50

IC50(half maximal inhibitory concentration),即半抑制濃度,指某一種物質(zhì)對某些生物程序抑制達到50%抑制效果時的濃度。對細胞增殖方面,可以理解為對細胞增殖的抑制效果達到細胞正常增殖水平50%時的藥物濃度。通常用IC50來衡量藥物對細胞的毒性或者細胞對藥物的耐受能力,在藥物實驗中,常用IC50來評估實驗中使用的藥物濃度。IC50的計算方法很多,常用的有Excel、graphpad prism、SPSS等。

B.  藥物濃度遞增法/大劑量藥物沖擊法

1) 大劑量藥物沖擊法：將處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞（匯合度60%-80%）置于含有濃度的藥物濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，更換不含藥物培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)，待細胞恢復(fù)生長，培養(yǎng)一段時間后重復(fù)上述操作，將篩選出的細胞在一定濃度的藥物濃度培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)依這樣不斷改變作用時間，共經(jīng)過1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h共10個作用時間段，約6-8個月的培養(yǎng)，最終使得細胞能夠在一定濃度的藥物的培養(yǎng)液中持續(xù)穩(wěn)定生長并傳代，然后脫藥培養(yǎng)1個月在檢測細胞的生物特性及耐藥指標(biāo)。　

大劑量藥物沖擊法優(yōu)點是與臨床上大劑量化療藥物沖擊的治療方式相接近，但是缺點在于大劑量藥物沖擊法的藥物濃度很高，細胞培養(yǎng)由于外環(huán)境驟變，細胞可能難以耐受，細胞狀態(tài)較難控制，且耐藥性能不穩(wěn)定。

2) 藥物濃度遞增法：取處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞（匯合度60%-80%），加入起始濃度為低濃度（建議為親本細胞株的IC50的1/10-1/5）的藥物作用24h，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，更換不含藥物培養(yǎng)基，細胞恢復(fù)生長后，消化傳代復(fù)以低濃度作用細胞24h，待細胞增殖至正常形態(tài)后，重復(fù)上述藥物沖擊，每種濃度沖擊6-8次。待細胞在此濃度穩(wěn)定生長后，提高藥物濃度繼續(xù)培養(yǎng)，藥物依次遞增濃度加藥。藥物誘導(dǎo)歷時6-8個月，直到細胞能夠在濃度的藥物中穩(wěn)定生長。

藥物濃度遞增法優(yōu)點在于誘導(dǎo)耐藥細胞的藥物劑量循序漸進，細胞培養(yǎng)的外環(huán)境逐漸改變，細胞較易耐受，狀態(tài)較好，缺點在于誘導(dǎo)耐藥過程耗時很長，且其化療藥物的作用方式與臨床上化療藥物大劑量短療程的化療原則存在一定的差異；

C.  檢測耐藥細胞株的IC50　　

檢測耐藥細胞株的IC50，根據(jù)IC50值計算出耐藥指數(shù)（resistanceindex, RI），RI=耐藥細胞系的IC50/親代細胞系的IC50，RI>5則認為耐藥細胞系的耐藥性符合耐藥株的要求。