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細(xì)胞收到后注意事項(xiàng)

1、收到細(xì)胞，請(qǐng)查看瓶子是否有破裂，培養(yǎng)基是否漏出，是否渾濁，如有請(qǐng)盡快聯(lián)系

2、收到細(xì)胞，如包裝完好，請(qǐng)?jiān)陲@微鏡下觀察細(xì)胞。,由于運(yùn)輸過程中的問題，細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的貼壁細(xì)胞有可能從瓶壁中脫落下來，顯微鏡下觀察會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞懸浮的情況，出現(xiàn)此狀態(tài)時(shí)，請(qǐng)不要打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶，先不要把培養(yǎng)基吸出來。應(yīng)立即將培養(yǎng)瓶置于細(xì)胞培養(yǎng)箱里靜止3-5小時(shí)左右，讓細(xì)胞先穩(wěn)定下，再于顯微鏡下觀察，此時(shí)多數(shù)細(xì)胞會(huì)重新貼附于瓶壁。如細(xì)胞仍不能貼壁，請(qǐng)用臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活力，如臺(tái)盼藍(lán)染色證實(shí)細(xì)胞活力正常請(qǐng)按懸浮細(xì)胞的方法處理

3. 收到細(xì)胞時(shí)如無異常情況 ，請(qǐng)?jiān)陲@微鏡下觀察細(xì)胞密度，如為貼壁細(xì)胞，未超過80%匯合度時(shí)，用75%酒精（建議配置75%酒精的水也是滅菌超純水。噴灑整個(gè)瓶消毒后放到超菌臺(tái)內(nèi)，嚴(yán)格無菌操作：然后打開蓋子，先用槍頭把培養(yǎng)基吸出10ML左右，放在離心管里，然后瓶口過火，（嚴(yán)禁直接傾倒），這樣可以保證不污染，再用10ML的移液管，將剩余的培養(yǎng)基全部吸出，放于離心管中，培養(yǎng)瓶中只剩余5-10ML左右培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)就可以了）：超過80%匯合度時(shí)，請(qǐng)按細(xì)胞培養(yǎng)條件傳代培養(yǎng)。

如為懸浮細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心3-5分鐘，吸出上清，管底細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞后移回培養(yǎng)瓶。

4，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，蓋子微微擰松。吸出的培養(yǎng)基可以保存在滅菌過的瓶子里，存放于4℃冰箱，以備不時(shí)之需。第二天換液時(shí)，要配制新鮮的培養(yǎng)基和進(jìn)口胎牛血清。這樣對(duì)細(xì)胞生長更好。不要再用我們?cè)康呐囵B(yǎng)基了。

5 、24小時(shí)后，細(xì)胞形態(tài)已恢復(fù)并貼滿瓶壁，就可以傳代了。（貼壁細(xì)胞）將培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)基倒去，加3-5ml（以能覆蓋細(xì)胞生長面為準(zhǔn)）PBS或Hanks’液洗滌后棄去。加0.5-1ml  0.25%含EDTA的胰酶消化，消化時(shí)間以具體細(xì)胞為準(zhǔn)，一般1-3分鐘，不超過5分鐘?？梢苑湃?7℃培養(yǎng)箱消化。輕輕晃動(dòng)瓶壁，見細(xì)胞脫落下來，加入3-5ml培養(yǎng)基終止消化。用移液管輕輕吹打瓶壁上的細(xì)胞，使之wan全脫落，然后將溶液吸入離心管內(nèi)離心，1000rpm/5min。棄上清，視細(xì)胞數(shù)量決定分瓶數(shù)，一般一傳二，如細(xì)胞量多可一傳三，有些細(xì)胞不易傳得過稀，有些生長較快的細(xì)胞則可以多傳幾瓶，以具體細(xì)胞和經(jīng)驗(yàn)為準(zhǔn)。（懸浮細(xì)胞）用移液管輕輕吹打瓶壁，直接將溶液吸入離心管離心即可。

6，貼壁細(xì)胞 ，懸浮細(xì)胞。嚴(yán)格無菌操作。換液時(shí)，換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶和換新鮮的培養(yǎng)液和進(jìn)口胎牛血清，37度    5%CO2 培養(yǎng)

7.  收到細(xì)胞后，請(qǐng)鏡下觀察細(xì)胞，用恰當(dāng)方式處理細(xì)胞。若懸浮的細(xì)胞較多，請(qǐng)離心收集細(xì)胞，接種到一個(gè)新的培養(yǎng)瓶中。棄掉原液，使用新鮮配制的培養(yǎng)基，使用進(jìn)口胎牛血清. 剛接到細(xì)胞，若細(xì)胞不多時(shí) 血清濃度可以加到15％去培養(yǎng)。若細(xì)胞迏到80%左右 ，血清濃度還是在10％。

 胰蛋白酶消化；

加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最佳消化溫度是37℃。顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。

吹打分散細(xì)胞：

吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中.平衡離心：平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液， 用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。