新西蘭胎牛血清(SFBS)

產(chǎn)品名稱：新西蘭胎牛血清

貨號：SFBS

規(guī)格：500ml

品牌：BOVOGEN

細胞培養(yǎng)最基本的是做好污染防控，包括微生物污染的防控和細胞系間交叉污染的防控。

實驗中需保持良好的操作習慣，所用材料的位置擺放要順手，污染源和已滅菌物品要分開放置。實驗室也需定期清潔與消毒。

※血清與培養(yǎng)基

通常血清的添加比例為10%，當然也可根據(jù)細胞狀態(tài)和生長速率適當增加或減少添加比例。在更換血清品牌或者批次時，最好需對血清的品質(zhì)進行驗證，防止對實驗造成影響。

對于培養(yǎng)基，目前商品化的比較成熟，穩(wěn)定性也較好。如若需自配培養(yǎng)基時，過濾前攪拌時間不宜過長（培養(yǎng)基中營養(yǎng)豐富，細菌常溫下20min就可繁殖一代，其代謝產(chǎn)物會對培養(yǎng)基的品質(zhì)產(chǎn)生影響）。培養(yǎng)基過濾除菌后，應對培養(yǎng)基進行無菌驗證，防止污染。

※細胞培養(yǎng)瓶

目前商品化的細胞培養(yǎng)瓶主要為瓶蓋是否帶氣孔兩種。其中不帶透氣孔細胞培養(yǎng)瓶擰緊后需適當回旋瓶蓋，保證CO2能順利進入細胞培養(yǎng)瓶。

細胞培養(yǎng)過程中，對于適應能力強的腫瘤細胞，可在傳代3-4次后更換新的細胞培養(yǎng)瓶。對于非腫瘤細胞系如293T，HEK293等細胞，建議每次傳代更換新的細胞培養(yǎng)瓶來保證細胞狀態(tài)。

※細胞傳代

正常細胞形態(tài)較好，輪廓清晰，邊緣透亮，細胞增殖狀況良好。當貼壁細胞長到密度90%時，需進行傳代。

傳代時通常使用胰酶消化法。該方法又分為干消化法和濕消化法。

干消化法：胰酶浸潤后棄去胰酶，待細胞變圓后加入新鮮培養(yǎng)基吹下后再進行細胞傳代。

濕消化法：待細胞變圓，肉眼觀察下成流沙狀脫落時即可加入新鮮培養(yǎng)基終止消化，1000rpm離心5min,棄去上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸傳代。

吹打細胞時，手法要輕柔，避免吹打出氣泡，造成細胞因內(nèi)外壓差破裂，同時需避免刮到瓶壁影響細胞的貼壁。

不同細胞的貼壁能力不同，消化時間不同；不同細胞細胞間連接強度不一樣，消化時間不同；同一細胞生長狀狀況不同，消化時間不同。消化時適時觀察細胞形態(tài)，避免因過度消化影響細胞活性。

傳代間隔時間和傳代比例因細胞而異。細胞傳代過程中，當細胞出現(xiàn)狀態(tài)不好或者污染時及時棄去細胞，重新復蘇。

※細胞凍存與復蘇

當細胞生長狀況較好或者代數(shù)較早時，需及時大量的凍存。

細胞凍存液比例為培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1，也可血清：DMSO=9:1。細胞凍存密度通常為1-3×106個/ml。細胞凍存采用慢凍方式，減少冰晶形成，避免細胞損傷。通常4℃放置0.5 h，-20℃放置2 h，-80℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

細胞復蘇時升溫要快，防止在解凍過程中水分進入細胞，形成冰晶，影響細胞存活。38℃水浴不時搖動，在1分鐘內(nèi)使其*融化，1000rpm離心5min,棄去上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸移入培養(yǎng)瓶中。

※用真誠感動細胞

俗話說，心誠則靈。對待細胞培養(yǎng)也應如此，“自己要用的細胞自己養(yǎng)"，多去觀察細胞生長狀態(tài)。

所謂“知彼知己，百戰(zhàn)不殆"。培養(yǎng)細胞需要我們的耐心以及不斷的摸索和積累，了解了每種細胞各自的習性后，再“傲嬌"的細胞也能在我們的“真誠"下認真“成長"※※※※

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貼壁細胞傳代：

1）移棄使用過的細胞培養(yǎng)液。（不要直接倒掉，避免瓶口殘留導致易污染）

2）使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液（PBS）沖洗細胞。從與貼壁細胞層相對的容器一側輕輕加入沖洗液，以避免攪動細胞層，前后搖晃容器數(shù)次，最后移棄沖洗液。（洗去殘留的血清，避免影響胰酶的活性。）

3）以 25 cm2的培養(yǎng)瓶為例，向瓶內(nèi)加入1ml胰蛋白酶-EDTA（請根據(jù)各細胞的指引使用合適的濃度）消化液，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細胞表面，放到37 ℃ 孵育。通常，幾分鐘內(nèi)，會發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大，傾斜培養(yǎng)瓶時細胞層能自然流下，此時應加入2-3ml含血清的*培養(yǎng)液終止消化（細胞解離所需時間請參考各細胞的指引，并建議每隔30秒在顯微鏡下觀察細胞的解離情況）。另外，并不是所有貼壁細胞都適用采用胰蛋白酶進行解離，請根據(jù)各細胞的指引選擇合適的解離方法。

4）使培養(yǎng)瓶傾斜，吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)液體輕輕沖向原細胞生長表面，重復該動作2-3次，使所有細胞沿瓶底流下，再輕柔地把細胞吹打成單個懸液（吹打過程中應避免氣泡的產(chǎn)生）。

PS：對于難消化的細胞，盡量不要通過用力吹打的方式來處理，以免對細胞產(chǎn)生物理損傷?？梢韵葘⒁呀?jīng)消化的細胞分出來，及時終止消化。然后再對仍然貼壁的細胞進行再次消化。做到分層消化，避免易消化細胞長時間在胰酶消化下受損。

5）把所有的細胞懸液轉移到15ml離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘后移棄上清。

6）加入新的含血清*培養(yǎng)液重懸成單細胞懸液。按各細胞指引推薦的傳代比例，把細胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中，補足新的含血清*培養(yǎng)液，輕輕搖晃混勻。

7）放到37 ℃ 孵育，第二天顯微鏡下觀察細胞的貼壁情況。

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9、如何區(qū)分活細胞和死細胞?

顯微鏡下觀察：活細胞中間透亮，飽滿，有光澤，死細胞較暗。也可以通過臺盼藍染色來計算細胞活力。

10、如何用臺盼蘭計數(shù)活細胞?

用無血清培養(yǎng)基把細胞懸液稀釋到200～2000 個/毫升，在0.1 毫升的細胞懸液中加入0.1 毫升的0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，用血球計數(shù)板計數(shù)細胞?；罴毎懦馀_盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞，注意計數(shù)需在加入臺盼藍10min內(nèi)完成。有細胞計數(shù)儀的，可直接用計數(shù)儀進行。

11、二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。

12、使用胰蛋白酶加入EDTA是為什么?

EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。

13、可否使用與原先不同的培養(yǎng)基?

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應的細胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細胞大都無法立即適應，易造成細胞狀態(tài)不好，最終造成細胞無法存活。

14、可否使用與原先不同的血清種類?

不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

15、細胞為何生長不均勻?

細胞傳代后放入培養(yǎng)箱沒有搖勻，或者放入時搖勻，但在細胞貼壁前，又移動了培養(yǎng)瓶，頻繁開關培養(yǎng)箱引起的振動或者培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液過少，培養(yǎng)箱擱板表面不平整，這些因素會導致細胞生長不均勻。

16、購買的細胞死亡或細胞存活率不佳

研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。運輸過程對細胞有嚴重影響。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于–80°C太久。

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人肝癌細胞 smmc-7721

人腦膠質(zhì)瘤 SNB-19

人肝癌細胞 snu-1

人肝癌細胞 Snu-182

人膀胱上皮永生化細胞 sv-huc-1

人滑膜肉瘤細胞 SW982 [SW-982]

人結腸腺癌細胞 SW1116

人腎上腺皮質(zhì)小細胞癌細胞 SW-13

人腎上腺皮質(zhì)小細胞癌細胞 SW1353

人胰腺癌細胞 SW1990

人結腸腺癌細胞 SW480

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人結直腸腺癌細胞 SW620

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人膀胱移行細胞癌 SW780

人膀胱移行細胞癌細胞 T24

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人食管癌細胞 TE-1

人食管癌細胞 TE-12

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人腦膠質(zhì)瘤 TJ905

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人喉癌細胞 TU212

人喉癌細胞 TU-138

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人腦星形膠質(zhì)母細胞瘤 U87MG

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人淋巴瘤細胞 U-937

人膀胱移行細胞癌 UM-UC-3

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人乳腺癌細胞 ZR-75-1

17、細胞抱團怎么處理?

一些懸浮細胞抱團生長是正?，F(xiàn)象，大部分懸浮細胞在細胞密度很高的情況下，很可能會出現(xiàn)部分細胞抱團生長的現(xiàn)象，聚團細胞很容易死亡并演化成絮狀物，殃及周圍的懸浮細胞，因此在培養(yǎng)懸浮細胞時需控制好細胞密度。如果出現(xiàn)了細胞團，可以通過細胞篩去掉部分較大的細胞團，也可以嘗試一下方法：將細胞懸液收集到15 ml離心管中，靜置20 min左右，小心取上層細胞上清培養(yǎng)(該方法只能去除部分較大的細胞團)。

18、細胞內(nèi)有空泡，是否是正常現(xiàn)象?

部分細胞本身存在一定的空泡(如HepG2，Ishikawa及一些耐藥株等)，這個是正?，F(xiàn)象。如果只有少數(shù)細胞有內(nèi)出現(xiàn)極少空泡，則很可能是細胞狀態(tài)不佳，可以通過調(diào)整血清濃度，控制消化，控制傳代比例及時間等方法來調(diào)整細胞狀態(tài);如果大部分細胞出現(xiàn)空泡，且單個細胞內(nèi)空泡數(shù)目偏多，則可能細胞代次較高，細胞老化所致，需更換代次較早的細胞。

19、細胞傳兩代后開始逐漸死亡的原因

很可能是培養(yǎng)體系不適合細胞(未使用推薦的培養(yǎng)體系);或者消化過度，對細胞有嚴重影響;或者是傳代比例不合適(具有密度依賴性的細胞，傳代太稀;或者生長較快的細胞，傳代較密，細胞嚴重堆疊生長)。

20、細胞生長逐漸變慢是什么原因?

細胞增殖變慢有以下原因：1. 消化過度 2. 傳代過密 3.細胞營養(yǎng)不良 4.細胞頻繁傳代 5.細胞狀態(tài)不佳或老化 6.細胞存在污染。

21、培養(yǎng)細胞時應使用5%或10%CO2?

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO2濃度。當培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7 g時，細胞培養(yǎng)時應使用10% CO2;當培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5 g時，則應使用5% CO2培養(yǎng)細胞。

22、CO2培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔?

定期(每周一次)更換水盤里面的水，水盤的水必須使用無菌蒸餾水或無菌去離子，水盤中可添加1%硫酸銅以預防霉菌污染。

23、細胞接種密度多少合適?

依照細胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長的一個重要原因。按照我們的經(jīng)驗：一般倍增時間24 h內(nèi)的細胞，傳代比率1:6-1:12為宜，倍增時間24-48 h的細胞，傳代比率1:3-1:8為宜，倍增時間超過48h的細胞, 傳代比率1:2-1:4為宜。

24、培養(yǎng)中常出現(xiàn)一些黑點，是污染嗎?

首先肉眼觀察培養(yǎng)液是否變渾濁，如果變渾濁，基本可以確定是污染;如果肉眼觀察培養(yǎng)液沒有變渾濁：在顯微鏡下觀察黑點大小和形狀是否規(guī)則，是否運動，是做布朗運動還是呈直線型快速移動。如果黑點大小不規(guī)則，做布朗運動，黑點可能是細胞碎片(可能是細胞狀態(tài)不佳或者消化過度引起的)，也可能是血清反復凍融產(chǎn)生的蛋白沉淀引起的，也可能是細胞的代謝產(chǎn)物。如果黑點大小一致，快速移動，很可能是細菌污染。

25、如何預防細胞培養(yǎng)中黑點的產(chǎn)生?

掌握細胞傳代的最佳時機，不要細胞長老了再傳代;掌握好消化時間，防止消化過度產(chǎn)生細胞碎片;減少血清等試劑的凍融次數(shù);將培養(yǎng)液的PH調(diào)到最佳;嚴格控制水質(zhì)和器皿的清潔。

26、黑點已經(jīng)產(chǎn)生了，如何進行處理?

如果判定黑點是污染，請及時將細胞處理后丟棄。其他情況，可參照以下進行：

如果是懸浮細胞：收集細胞上清慢速離心(500-600 rpm/min，5-6 min)并更換新的培養(yǎng)瓶;如果是貼壁細胞：將細胞用PBS洗2-3遍，洗的時候，輕輕拍打培養(yǎng)瓶，讓貼壁不牢的碎片和顆粒脫落，再棄去PBS，消化時先加低濃度的胰酶如0.05%胰酶消化1 min左右，讓細胞間隙中的顆粒和碎片脫落下來，去掉低濃度胰酶，然后正常消化細胞，將收集的細胞懸液慢速離心(500-600 rpm/min，5-6 min)并更換新的培養(yǎng)瓶，并可以嘗試適當增加血清濃度進行培養(yǎng)。

27、培養(yǎng)用dish,flask是否相同？

不同廠牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，雖對大部分細胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之生長差異。

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