人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細(xì)胞

nk-92mi細(xì)胞

NK-92MI專用培養(yǎng)基

懸浮

淋巴母細(xì)胞樣 成團(tuán)聚集

細(xì)胞傳代

18.細(xì)胞傳代的方法都有哪些？

根據(jù)不同的細(xì)胞采取不同的方法。貼壁生長的細(xì)胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細(xì)胞用直接吹打即可傳代；懸浮生長的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打。

19.原代培養(yǎng)的傳代應(yīng)注意的問題？

細(xì)胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代；原代培養(yǎng)時細(xì)胞多為混雜生長，不同的細(xì)胞有不同的消化時間，因此要根據(jù)需要注意觀察及時處理，并根據(jù)不同細(xì)胞對胰蛋白酶的耐受時間而分離和純化所需要的細(xì)胞；

吹打細(xì)胞時動作要輕巧盡可能減少對細(xì)胞的損傷；傳代時細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細(xì)胞生存和增值；隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶。

20.使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的？應(yīng)如何處理？

EDTA作用較胰蛋白酶緩和，主要作用在于能從組織生存環(huán)境中吸取Ca2+、Mg2+，這些離子是維持組織完整的重要因素。但EDTA單獨使用不能使細(xì)胞*分散，因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果較好。常用比例為1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶。EDTA的工作液濃度為0.02%，用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA，在終止消化前，需用緩沖液將消化液清除后才能加培養(yǎng)液。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于 –20 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成胰蛋白酶的活性降低，并可減少污染的機會。

21.欲將一般動物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？

欲回收動物細(xì)胞，其離心速率一般為800~1000 rpm，5~10 分鐘，過高的轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。

22.細(xì)胞的接種密度為何？

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長的重要原因之一。

23.細(xì)胞交叉污染的可能原因？

多種細(xì)胞系進(jìn)行維持傳代操作時，各細(xì)胞系所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開，往往會使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。

細(xì)胞凍存

24.冷凍培養(yǎng)基為什么要加DMSO？

因為細(xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況下直接凍存時，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會很快形成冰晶，冰晶的形成將造成細(xì)胞損傷，還可引起細(xì)胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保護(hù)劑。這兩種細(xì)胞無明顯毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點下降，提高包膜對水的通透性。

25.DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何？ 

冷凍保存使用的 DMSO 等級，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于 4 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染的機會。若要過濾 DMSO，則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質(zhì)濾膜。 

26.欲冷凍保存時，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？ 

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。

27.冷凍保存細(xì)胞的方法？ 

冷凍保存方法一：冷凍管置于 4 ℃ 30~60 分鐘 →-20 ℃ 30 分鐘 → -80 ℃ 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 長期儲存。 

冷凍保存方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序的可程序降溫機中每分鐘降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存。–20 ℃ 不可超過 1 小時，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。

28.細(xì)胞凍存太多會不會浪費？

每一種細(xì)胞系都應(yīng)有充足的凍存儲備，防止由于細(xì)胞污染等因素造成的細(xì)胞系的絕種，而且每一批次培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)都不同，應(yīng)該挑選幾個狀態(tài)較好的批次凍存保種。另外二倍體細(xì)胞等有限細(xì)胞系如果暫時不用最好凍存以免傳代太多，造成細(xì)胞衰老或者發(fā)生改變。

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nk-92mi細(xì)胞

01冷凍管應(yīng)如何解凍？
取出冷凍管后，須立即放入37 °C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。

注：操作時戴好手套，防止凍傷；帶上防護(hù)眼鏡可以防止液氮罐里剛剛拿出來的管子液氮爆炸……

復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3 分鐘）。解凍后的細(xì)胞可以直接接種到含有*培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng)，24小時后再用新鮮*培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO。如果細(xì)胞對冷凍保護(hù)劑特別敏感，解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含*生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。

02細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應(yīng)馬上去除DMSO？

除少數(shù)特別注明對DMSO敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，可直接放入10-15ml新鮮培養(yǎng)基，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題。

03細(xì)胞培養(yǎng)時能否更換培養(yǎng)基種類？
首先得確定現(xiàn)在用的培養(yǎng)基是否適合您的細(xì)胞生長。細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞增殖和形態(tài)正常的情況下最好不要更換培養(yǎng)基，細(xì)胞都有各自適應(yīng)的培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)條件，細(xì)胞可能無法快速適應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。若必須更換，可嘗試半換，讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新的培養(yǎng)基。

更換培養(yǎng)基的方法：如果是貼壁生長的細(xì)胞， 一般可以直接把培養(yǎng)液吸掉， 再加入新的。加的時候注意不要對著長細(xì)胞的那一面。如果是懸浮型的， 就需要低速離心 （把所有的細(xì)胞和培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心管里， 或有些離心機配有直接離心細(xì)胞培養(yǎng)皿的裝置）， 然后再吸掉上清液。加入新的培養(yǎng)液使細(xì)胞重新懸浮。

04細(xì)胞培養(yǎng)時能否更換胎牛血清？
首先要確定更換胎牛血清的理由，如果細(xì)胞培養(yǎng)無異常的話，不建議隨意更換不同品牌和來源的胎牛血清。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的來源（血源地）和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同地域和等級的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細(xì)胞死亡。如果是使用的胎牛血清出現(xiàn)了問題，比如保存不當(dāng)或操作不當(dāng)導(dǎo)致血清成分析出、混濁、污染等情況，可以優(yōu)先更換同品牌、等級、批次的血清。如果是產(chǎn)品質(zhì)量問題更換血清品牌的話，需要用一批細(xì)胞進(jìn)行預(yù)實驗才行，以保證細(xì)胞能夠正常培養(yǎng)。另外大家在購買胎牛血清的時候要選擇正規(guī)來源，非正規(guī)來源的胎牛血清有很多安全隱患，對實驗室、操作人員、細(xì)胞培養(yǎng)、實驗數(shù)據(jù)都有很大的影響。
05培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用多少濃度的二氧化碳？
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO₂濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7 g時，細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10%CO₂；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5 g時，則應(yīng)使用5% CO₂培養(yǎng)細(xì)胞。

06一般在拿到細(xì)胞后，應(yīng)該注意什么？

收到細(xì)胞后先不要開蓋，放在培養(yǎng)箱靜置若干小時后（看細(xì)胞密度而定）在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議對收細(xì)胞時的培養(yǎng)基拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，顯微鏡下拍細(xì)胞100X，200X各一張），排除細(xì)胞本身污染的情況；收到細(xì)胞未開封，出現(xiàn)污染狀況一般可以再申請免費發(fā)送一株細(xì)胞。

收到細(xì)胞時如無異常情況，請在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度，如為貼壁細(xì)胞，未超過80%匯合度時，將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液吸出，留下10ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；超過80%匯合度時，請按細(xì)胞培養(yǎng)條件傳代培養(yǎng)。如為懸浮細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液、1000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，吸出上清，管底細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞后移回培養(yǎng)瓶。

細(xì)胞消化液建議使用PBS配制，慎用Hanks液配制。

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